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澳门新葡亰平台游戏:骨髓间充质干细胞分离培

鼠牙囊细胞的原代分离培养方法

长期以来,人们认为中枢神经系统成熟的神经元很难或不能在进行分裂和增殖,属于终末分化细胞。因而中枢神经系统的损伤、变性导致的神经元丢失及缺损难以修复,神经功能的重建被视为几乎不可能。神经干细胞在体外分离培养和增殖的成功,为中枢神经系统再生和功能重建提供了新的可能途径。

核心提示:PriCells -正常小鼠原代脑星形胶质细胞培养PriCells -正常小鼠原代脑星形胶质细胞培养此文章来源于:武汉原生原代生物医药科技有限公司技术支持 | 浏览次数:160 | 时间:2010-1-25PriCells –正常小鼠原代脑星形胶质细胞培养一、实验试剂1、培养基: PriCells Medium

核心提示:一、骨髓间充质干细胞的分离目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法,全骨髓法即根据干细胞贴壁特性,定期换液除

时间:2016-12-23 08:56点击: 次来源:网络作者:admin评论:- 小 大

“养细胞难、养原代细胞更难、养原代神经干细胞难上加难!”

  • 10% FBS 1% P/S PriCells Supplement2、冻存液: PriCells Medium 20% FBS 10% DMSO3、洗涤液: 1 × PBS 1% P/S4、染色液: 0.4% Trypan Blue5、消化液: PriCells Isolation of Primary Cell Kit6、检测试剂:抗小鼠CD 11b/c抗体,荧光标记二抗,乙醇丙酮混合液二、实验器械1、培养皿2、培养瓶3、直剪和眼科剪4、眼科镊和止血钳5、10ml注射器6、玻璃滴管7、烧杯8、15ml离心管三、实验流程取材↓去除大脑脑膜及血管,剔除海马部分↓1 × PBS 漂洗3次,去掉表层血丝↓先用眼科镊将组织撕碎成糜状,用眼科剪反复剪10min,再用移液器轻轻吹打20~30次。↓将组织转移至15ml离心管中,加入消化液↓将离心管放置到37℃,15-20min水浴恒温消化↓加入消化终止液终止反应↓离心,1000rmp,10min,弃去上清↓重悬,计数细胞↓接种密度以1 × 106个/ml↓培养37℃,5%CO2四、实验操作1、培养瓶预包被。试验前一天预包培养瓶,置于超静台吹干或45℃烘箱烘干,4℃冰箱放置,备用。2、取材:正常昆明小鼠。3、材料预处理:将小鼠处死后浸泡入体积分数75% 乙醇中消毒,以血管钳从后夹住颈部,用眼科剪从枕部向前依次分开头皮及颅骨,再用眼科镊依次剥离,剔除脑膜及血管。取大脑置于1 × PBS 中,漂洗去表层血丝,至脑组织呈乳白色。4、消化液:用眼科镊将组织撕碎成糜状,再用眼科剪反复剪10min,最后再用移液枪轻轻吹打20~30次,将剪碎的组织用枪转移至15ml离心管中,37℃水浴消化15min。5、终止消化:按1:1加入消化终止液,中止酶反应。6、收集重悬细胞:1000 rpm,离心10 min,弃去上清,加入培养液重悬,染色计数细胞。7、培养细胞密度:调整细胞密度以1 × 106个/ml 接种入培养瓶。8、培养:放置于37℃,5% CO2培养箱中。五、细胞鉴定1、显微鉴定:相差显微镜下,可见细胞呈星形状,细胞密度增高后呈现鹅卵石样镶嵌排列,有接触抑制的特点。细胞具备良好的透光性。2、免疫组织化学鉴定 :利用OX-42 免疫荧光染色。3、细胞爬片。将洗净的盖玻片放入6孔培养板中,接种细胞为3×104个/孔,48小时候细胞可以长满,用镊子取出铺满细胞的盖玻片备用。4、细胞固定:用PBS洗涤细胞,之后放入乙醇丙酮混合液中,固定10min,空气中自然干燥。5、特异性抗体:按照说明书稀释比要求稀释抗体,加入抗体,放置37℃孵育60min。6、洗涤:1 × PBS 洗涤3次 × 15 分钟,晾干。7、标记性抗体:加入荧光标记抗体,37℃孵育30min。洗涤:1 × PBS 洗涤3次 × 15 分钟,晾干。8、封片:封片剂封片。9、镜检:荧光显微镜下观察,胶质细胞包质呈现较强黄绿色荧光,细胞核周围尤其明显。六、注意事项1、选材注意选取新生昆明小鼠。取材过程尽可能保证无菌,尽量剔除脑膜及血管和海马部分。2、注意尽可能消除脑组织表面的残血,避免血细胞及某些血清成分对胶质细胞贴壁的影响。3、胶质细胞分离损伤严重影响胶质细胞的生长,因此应严格掌握好酶的消化浓度和消化时间。4、严格控制胶质细胞培养条件。包括细胞培养用液(培养基,生长因子,血清,抗生素)的质量,浓度。5、关于培养瓶包被与否,有文献研究显示包被与未包被之间没有特别大的差异。 实验中,可以酌情考虑是否包被。6、传代培养细胞接种量为1×106个(25 cm2培养瓶),细胞倍增时间为36小时。细胞传代培养最佳为5-8代, 传代次数增加,细胞体积增大,细胞之间间隙增加,细胞贴壁牢固,传代消化时间会有所延长。七、PriCells细胞图片澳门新葡亰平台游戏 1

一、骨髓间充质干细胞的分离

牙囊在牙萌出时期占据的天然重要位点使其在调节破骨和成骨平衡、牙槽骨活性、牙萌出发挥重要作用,下面是小编搜集整理的一篇探究鼠牙囊细胞原代分离培养方法的论文范文,供大家阅读查看。

今天,东澳金牌实验员为大家详细讲解原代神经干细胞取材及培养的那些事,手把手教你轻松搞定~

目前常用的分离MSC的方法有全骨髓法和密度梯度离心法,全骨髓法即根据干细胞贴壁特性,定期换液除去不贴壁细胞,从而达到纯化MSC的目的。密度梯度离心法即根据骨髓中细胞成分比重的不同,提取单核细胞进行贴壁培养。随着对MSC表面抗原认识的深入,有人利用免疫方法如流式细胞仪法、免疫磁珠法等对其进行分离纯化,但经过流式或磁珠分选后的细胞出现了增殖缓慢等一些问题,加之耗费较大和技术的难度,在某种程度上限制了这些方法的广泛应用。

牙囊起源于外胚间充质,是包绕在成釉器周围和牙乳头底部呈囊状排列的结缔组织,其在牙齿萌出后期可形成牙骨质、牙周膜和固有牙槽骨。牙囊是牙萌出的必需条件之一[1],并在组织、细胞和分子等多个水平上调控牙齿的萌出[2-3].Wise等[4]首次报道了采用改良组织块酶消化法进行大鼠牙囊细胞的体外培养,凌均棨等[5-6]、叶国[7]、刘晓辉等[8]也采用不同或类似的方法先后进行了大鼠牙囊细胞体外培养并取得成功。而小鼠牙囊细胞的原代分离培养仅有葛少华等[9-10]采用改良组织块培养法获得成功,国外尚未见相关报道。小鼠作为应用广泛的模式动物之一,在牙萌出领域的研究中具有其他动物无法比拟的优势。但小鼠牙囊细胞的分离培养却较其他动物困难,大大限制了其应用范围。本实验通过比较酶消化-组织块法和二次酶消化法在小鼠牙囊细胞原代培养中的优缺点,以期为进一步研究牙囊细胞的生物学特性奠定基础。

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1.直接培养法1987年,Friedenstein等发现在塑料培养皿中培养的贴壁的骨髓单个核细胞在一定条件下可分化为成骨细胞、成软骨细胞、脂肪细胞和成肌细胞,而且这些细胞扩增20-30代后仍能保持其多向分化潜能,这类细胞即为骨髓间充质干细胞,其工作对今后MSC的研究具有重要意义,不仅证实了骨髓MSC的存在,而且创建了一种体外分离和培养MSC的简便可行的方法,得到了广泛的应用。culture-spirit采用直接贴壁法,24-36小时首次换液,换液时用PBS洗两次,7-10天传第一代,以后2-3天传代。培养基采用Hyclone的DMEM/F-12,血清是天津TBD的FBS,得到了较好的培养结果。布兰卡根据自己培养大鼠MSC的经验,详细介绍了实验步骤:接种后60-80分钟,换液去除悬浮细胞原代培养24h,48h各换液一次观察细胞情况,在原代培养7天左右时,如观察到成片的典型形态的细胞,在瓶底用Marker笔标记,0.25%胰酶消化,镜下观察控制,约5-10分钟(室温太低时应放置到孵箱中),加入全培养基终止消化,瓶体朝上,吸管轻轻吹打4-8分钟,尤其是标记部位。不要用力吹打,以免把贴壁较牢的成纤维细胞,上皮样细胞吹打下来传代到新瓶中,加入少量培养基,孵箱静置20-30分钟后,MSC大多牢固贴壁。瓶底朝上,轻轻吹打,丢弃悬浮以及贴壁不牢的细胞,加入全培养基开始传代培养,如观察仍有较多杂细胞,可重复上述步骤。经上述处理后,原代的那瓶细胞仍有一些MSC生长,可继续按原代培养,如观察到MSC的克隆,仍可按上述步骤纯化处理。原代或传代的细胞如观察的少量成片的杂细胞,可直接镜下瓶底标记后,超净台里用长吸管尖端机械刮除,吸出去掉。菊花与刀用的是全骨髓培养法,直接用含10%的FBS培养基冲洗大鼠的股骨和胫骨,为了避免冲起许多气泡应缓慢冲,冲的次数不应太多。冲洗后不用离心直接接种在培养瓶里,48h澳门新葡亰平台游戏,~72h后首次换液,一般7~10天可传代。天之饺子介绍的小鼠MSC的分离方法:取6w小鼠的股骨和胫骨,直接用含培养基冲出骨髓,一定要尽量把干垢端的骨髓冲干净。冲洗后不离心直接接种在培养瓶里,24-48h后去悬浮,再接下来的每3-4天换液一次,直到需要传代。

1材料和方法

神经干细胞

2. 密度梯度离心法裴雪涛等用比重为1.073g/ml的percoll分离(400g×20min)人骨髓MSCs,取界面处细胞层,离心后洗涤以2×105/cm2的密度接种,72h后更换培养液,弃掉未贴壁细胞,以后每3d换液一次。细胞长到80%汇合时1:1传代。菊花与刀利用PERCOLL密度1.073分离大鼠MSC 时,用2400rpm×20mins后可见中间有一层约1~2mm厚的白色层,仔细用吸管吸取这一层再用PBS离心2遍即可加培养基和胎牛血清培养即rMSCs,。周进明等利用密度为1.082的percoll分离小鼠MSCs,500g×30min离心后,取中间的单个核细胞层,PBS洗两次,接种于IMDM培养基,1d后换液,去掉非贴壁细胞,以后每3-4天换液。jetter用过FICOLL,FERCOLL,上海二分厂的淋巴细胞分离液分离MSC细胞效果都不错,当然所获细胞群的纯度不一,Percoll最纯,而上海二分厂的淋巴细胞分离液所获细胞群的传代能力优秀(35 PASSAGE)。本版的部分园友认为MSC贴壁培养得到的细胞不均一,但是多能分化能力和增殖力好,percoll分离得到的细胞较为均一,多能分化性和增殖力不如贴壁培养的,尤其是增殖力相差很远,有人添加bFGF或/和表皮生长因子发现可以增强增殖能力。

1.1主要试剂、仪器和实验动物

神经干细胞是指具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的能力,能自我更新并能提供大量脑组织细胞的细胞群,具有自我更新能力和多向分化潜能,对损伤和疾病具有反应能力。原代培养的单细胞在24h内自动聚集成团,这是神经干细胞在体外培养过程中的一个重要特征。

二、 骨髓间充质干细胞的培养天之饺子认为,间质干细胞的培养一定要用塑料培养瓶,不能用玻璃的。因为象间质干这类的基质细胞不易贴玻璃,而且现在买的进口好品牌的培养瓶都涂有一层促细胞贴壁的物质,多数园友培养时都添加10-15%胎牛血清。分离培养结果的差异可能是由于各个研究小组标本来源、采用的分离方法不同从而所获得的细胞不同,或者用来检测的细胞代数不同,或者培养过程中用的胎牛血清不同,导致MSCs获得或失去这些表面标记物的表达。三、 骨髓间充质干细胞的特性体外培养的MSC体积小,成梭形,核浆比大。不表达分化相关的细胞标志,如I、II、III型胶原、碱性磷酸酶或Osteopontin;也不表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124、CD166和多种表面蛋白,这群细胞特性稳定,扩增一代和两代后的细胞同质性分别达到95%和98%。MSC联系传代培养和冷冻保存后仍能具有多向分化潜能,而且保持正常的核型核端粒酶活性,但不易自发分化,在体外特定的诱导条件下,MSC可以分化为骨、软骨、脂肪、肌腱、肌肉、神经等多种细胞。

α-MEM培养基;胎牛血清、胰蛋白酶;I型胶原酶;EDTA、青霉素、链霉素;PBS;低速离心机;超净工作台;细胞培养箱;倒置相差显微镜;Balb/c仔鼠。

四、其他相关内容Jiang将从成人以及成年大鼠和小鼠骨髓分离的间充质干细胞(CD45-TER119-)命名为多潜能成年祖细胞,他们证明,MAPC高表达端粒酶,而且随着细胞的扩增,端粒的长度不变,单个MAPC来源的细胞群不仅能在体外向3个胚层的细胞分化,而且能在体内能够向各种组织细胞分化,相比较而言,形态与MSC相似的体外培养的皮肤成纤维细胞则不具有类似的分化潜能。

1.2牙囊组织的分离和获取

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参考Wise等[4]报道的方法并进行改进。取6只出生3~5d的Balb/c仔鼠,分别经脱颈法处死,750mL/L乙醇浸泡消毒1min后,外科法分离出1霉素和100μg/mL链霉素)中。体视显微镜下剥离牙胚周围的骨组织,分离出各小鼠的下颌第一磨牙和第二磨牙牙胚,并置于预冷的α-MEM培养基中。收集所有牙胚置于200μLI型胶原酶消化液中,37℃水浴20min后,将牙胚转移至预冷的α-MEM培养基中;然后在体视显微镜下分离牙囊和成釉器,并将剥离出的牙囊组织立即置于预冷的α-MEM培养基中待用。

原代取材及培养

1.3牙囊细胞的原代培养

步骤一.原代取材:

1.3.1酶消化-组织块法

1.脱颈处死2周龄孕鼠,孕鼠腹部以75%酒精消毒后,手术剪打开腹腔,取出子宫,剪开子宫,取出胎鼠,置于含冰冷PBS液的10cm培养皿中。

取上述方法获得的牙囊组织,分散成小块后以0.5cm的间距直接接种于24孔板,放置2~5min待组织块稍干并贴壁后,每孔加入含胎牛血清、青霉素、链霉素的α-MEM培养基各500μL,置于37℃、50mL/LCO2、饱和湿度条件下进行培养。

2.将胎鼠断头,用眼科剪分离颅骨及硬脑膜,取出脑组织,在显微镜下充分取出脑膜和血管组织。

次日轻吹悬浮未贴壁组织块,并用预温的培养基进行半量换液,倒置相差显微镜下观察;此后每2d半量换液1次,并严密观察细胞的状态,待细胞生长接近80%汇合时进行传代。

3.将脑组织用PBS清洗三次,剪成1mm3大小的组织块,至于含DMEM/F12的离心管中,吸管轻吹打10次,静置离心管1~2min,取细胞悬液。重复2-3次。

1.3.2二次酶消化法

4.细胞悬液以700r/min离心6min,吸除上清,获得细胞沉淀。用(DMEM/F12 1%N2 2

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